CEA-rV防治CEA阳性肿瘤的实验和应用研究 (2007-11杭州会议)-

祁岩超 杨波 王新帅 罗超权1 陶莎1 卢敏莹 潘东晓

广州医学院附属肿瘤医院 (广州 510095) 1中山大学医学院 (广州 510089)

    摘要 目的: 探讨CEA重组基因痘苗病毒(CEA-rV)对实验动物CEA阳性肿瘤的预防和治疗作 用,以及临床应用的安全性.

    方法:①预防组:将实验鼠分为4组, 先皮下接种痘苗病毒(1,２组野生型W-VV; 3,4组CEA -rV) 3次, 再分别皮下注射同源鼠肝癌细胞(1,3组Hepa-CEA-, 2,4组Hepa-CEA+). ②治疗组, 同样4组, 先皮下注射肝癌细胞 (1,3组Hepa-CEA-, 2,4组Hepa-CEA+), 7d后再分别皮下接种痘苗病毒(1,２组W-VV; 3,4组CEA-rV).以后每周测量一次肿瘤大小, 并观察动物反应. ③临床应用研究, 6位志愿者, CEA-rV 0.5ml皮下注射, 每两周一次, 共三次. 治疗前后查血清CEA值, 肿瘤体 积变化及不良反应.

    结果:①预防组:接种CEA-rV/ Hepa-CEA+组各鼠在观察期限内无肿瘤形成, 而3个对照组 各鼠皮下均有肿瘤形成, 并且以相近速度快速增长(肿瘤体积平均3.5cm3). ②治疗组, 接种Hepa-CEA+/CEA-rV组小鼠皮下肿瘤生 长缓慢, 瘤块较小(平均1 cm3), 而3个对照组肿瘤生长迅速, 瘤块较大(平均5 cm3). 无论预防组和对照组小鼠在整个实验过程 中均未表现有毒副反应. ③初步临床结果表明, CEA-rV对CEA阳性的结直肠癌和肺腺癌患者有一定的治疗作用, 而且没有严重毒 副反应.

    结论: CEA-rV对①实验性阳性肿瘤具有良好的预防和治疗作用, 而且预防作用更佳. ② CEA-rV对CEA阳性的肿瘤有一定的治疗作用, 且无明显的毒副作用.

    关键词: CEA重组基因痘苗病毒 预防 治疗 CEA阳性的肿瘤

Experimental and Applied Study of Preventive and Therapeutic Effect on CEA+-tumor by CEA-rV

Qi Yanchao, Liu Feng, Yang Bo, Wang Xinshuai, Luo Chaoquan1 and Tao Sha1

Guangzhou Tumor Hospital (Guangzhou 510095) 1Sun Yat-sen University of Medicine Science (Guangzhou 510089)

    Abstract Objective: To study the preventive and therapeutic effect of CEA recombinant vaccinia virus(CEA-rV) on CEA positive tumor and its safety in clinic application.

   Methods: Preventive group(A): 40 mice were divided into 4 groups, which were vaccinated by subcutaneous injection(SI) with wild-type vaccinia virus (W-VV) in 1st and 2nd group or CEA-rV in 3rd and 4th group for 3 times respectively at 14-day interval, and followed by SI of Hepa-CEA+ tumor cells in 1st and 3rd group or Hepa-CEA- tumor cells in 2nd and 4th group. Therapeutic group (B): 40 mice were divided into 4 groups, which were SI with Hepa-CEA- tumor cells in 1st and 3rd group or Hepa-CEA+ tumor cells in 2nd and 4th group respectively, and followed by SI of W-VV in 1st and 2nd group or CEA-rV in 3rd and 4th group for 3 times at 14-day interval. The animal’s responses were observed weekly after tumor cells injection in both of A and B groups. ③The clinic applied study: 6 volunteer patients were SI with 0.5ml of CEA-rV for 3 times at 14- day interval. The value of serum CEA and tumor volume and side effect were observed before and after treatment.

    Results:①In the A group: Subcutaneous tumor grew rapidly at approximately the same rate (P> 0.05) in all 3 control groups (mass about 3.5cm3), however no tumor grew in the mice of 4th group which CEA-rV and Hepa-CEA+ tumor cells were injected. ②in the B group; The subcutaneous tumor were observed in all mice of control groups and the tumors (mass about 5cm3) grew relatively fast, no statistic significance between these 3 groups were obtained (P> 0.05), whereas the tumor in 4th group, which were injected with Hepa-CEA+ tumor cells and CEA-rV, grew slowly and the tumor mass was smaller (about 1cm3). The statistic difference was significant in comparison with the 3 control groups (P< 0.01). During the whole testing period, no toxic or side effect were seen in all animals of A and B groups. ③The clinic primary results showed that CEA-rV had fairly therapeutic effect on CEA+ patients of rectal-colon cancer and lung adenocarcinoma. No toxic or serious side effect was found in all patients.

   Conclusion: The results indicated that ①CEA-rV has well preventive and therapeutic effect on CEA+ tumor in testing animals, and preventive effect is better than therapeutic effect. ② CEA-rV has fairly therapeutic effect on the patients with CEA positive tumor, no toxic and side-effect were found in the clinic patients.

   Key Words: CEA-rV; preventive; therapeutic; CEA positive tumor

   CEA（Carcino embryonic antigen）是一种重要的肿瘤相关抗原。90%的胃肠道肿瘤，80%的非小细胞肺癌,50% 的乳腺癌都有CEA的高表达。这类肿瘤的死亡人数占肿瘤总死亡人数的60%强。这类病人死亡率高的原因之一，是由于CEA的抗原 性很弱，机体的免疫系统不能识别肿瘤表面的CEA，从而使肿瘤细胞逃避免疫系统的杀伤[1-2]. 近年来，肿瘤的免疫生物治疗已 成为肿瘤治疗的新模式。重组痘苗病毒技术的发展为肿瘤的生物治疗提供了有效的方法（3）。本文旨在利用CEA基因重组痘苗病 毒（CEA-recombinant vaccinia virus CEA-rV）对CEA阳性肿瘤的实验和临床应用进行探讨，以观察CEA-rV对CEA阳性肿瘤的治 疗效果．

   1.材料和方法：

   1.1逆转录病毒组质粒PLXSN-CEA的构建，PLXSN-CEA传染小鼠Hepa肝癌细胞的制备

    逆转录病毒组质粒PLXSN-CEA的构建，PLXSN-CEA传染小鼠Hepa肝癌细胞的制备参照文献［4］进行,CEA-rV及 W-VV(野生型痘苗病毒)的大量制备及滴度测定参照文献［５］进行.

    1.2 CEA-rV对CEA阳性肿瘤的预防作用。

    将40只KM鼠分成4组，每组10只，雌雄各半。体重18-22克,中山大学医学院实验动物中心提供(合格证 字:98A003)第1.2组每鼠颈背部皮下注射10ul 2.2X107PFU的W-VV，第3 ,4组接种等量的CEA-rV；每隔14天接种一次，共3次。在 第三次接种后第7天，第1，3组每鼠颈背部皮下注射2.6X105CEA阴性（Hepa-CEA-）的小鼠肝癌细胞。第2,4组接种等量的CEA阳性 （Hepa-CEA+）的小鼠肝癌细胞. 接种癌细胞后每周测量一次肿瘤的长径和宽径，计算肿瘤体积，公式为肿瘤体积V=（宽径W2X长 径L）X2

    1.3 CEA-rV对CEA阳性肿瘤的治疗作用。

    将40只KM鼠分成4组，每组10只，雌雄各半，第1.2组每鼠颈背部皮下接种 2.6X105CEA阴性小鼠肝癌细胞 （Hepa-CEA-）,第3, 4组每鼠颈背部皮下接种 2.6X105CEA阳性小鼠肝癌细胞（Hepa-CEA+）。7天后，1 , 3组每鼠皮下接种10ul 2.2x107Pfu的W-VV; 2,4组每鼠皮下接种10ul 2.2x107Pfu的CEA-rV。共接种三次，每次间隔14d。接种癌细胞后观察动物反应和 皮下肿瘤的出现情况，并每隔7天测量1次肿瘤长径和宽径，同样公式计算肿瘤体积。

    1,4 CEA-rV的临床应用研究

    病例选择，共治疗肿瘤患者6例，男5例, 女1例, 年龄32-66岁.其中结肠癌3例，肺癌2例，肝癌1例。CEA-rV ，05ml（108Pfu/ml）皮下注射，两周一次，共三次。CEA-rV治疗前后查患者血清CEA，及肿瘤体积变化情况和不良反应等。

   2．结果

   2.1病毒的繁殖及滴度测定

   CEA-rV共繁殖5批，将5批按实验方法所述得到的病毒液混合在一起共5ml，用24孔培养板测定滴度，统计 CEA-rV的蚀斑如下：10-8稀释度分别为25，20，18个，平均21个，10-9稀释度分别为5,5,4个,平均为4.6个，计算病毒滴度 [（21X108+4.6X109）/2]X20=6.7 X1010PFU/ml。 W-VV的滴度为（3+4+3）/3X108X20=6.6X109Pfu/ml

   2.2 CEA-rV对实验性CEA阳性肿瘤的预防作用

   结果见表1。接种CEA-rV和Hepa-CEA+组的小鼠在观察的6周时间内未见肿瘤形成。而且其它三组小鼠均见肿 瘤形成，并且相近速度生长，统计学分析无显著差异（P=0.886）。说明CEA-rV能完全预防CEA阳性肿瘤的形成，接种小鼠在实验 过程中未见有任何毒副反应。

表1.预防实验各组鼠肿瘤体积(Ⅹ±s:cm3)

肿瘤接种后时间（d）

组别         n          &nb sp;14                21 &nb sp;              28     ;            35      & nbsp;         42

1.        10       &n bsp;0.13±0.04        0.39± 0.08        0.93± 0.12        1.74± 0.23        3.60±0.06

2.        10       &n bsp;0.15±0.04        0.62± 0.13        1.09± 0.20        1.92± 0.35        3.58±0.40

3.        10       &n bsp;0.11±0.06        0.32± 0.06        0.85± 0.15        1.88± 0.40        3.46±0.78

4.        10       &n bsp;0.00±0.00        0.00± 0.00        0.00± 0.00        0.00± 0.00        0.00±0.00

1.  W-VV＋Hepa-CEA-  2.  CEA-rV＋Hepa-CEA-   3.  W-VV＋Hepa-CEA＋  4.  CEA-rV＋Hepa-CEA＋

  2.3 CEA-rV对实验性CEA阳性肿瘤的治疗作用

   结果见表2。接种Hepa-CEA+肿瘤细胞和CEA-rV组小鼠在观察的6周时间内肿瘤生长趋向缓慢(瘤体积平均 1cm3)，与其它三组相比，统计学分析有明显差异（P=0.007）；其它三组小鼠肿瘤均生长迅速(瘤体积平均5cm3)，统计学分析， 组间无明显差异（P=0.263）。说明CEA-rV能够强烈抑制CEA阳性肿瘤的生长。接种小鼠在实验过程中未见有任何毒副反应。

表2.治疗实验各组鼠肿瘤体积(Ⅹ±s:cm3)

肿瘤接种后时间（d）

组别         n          &nb sp;14                21               28                35                42

1.        10       &n bsp;0.29±0.06        1.00± 0.1        2.00± 0.04        3.71± 0.74        6.03±1.09

2.        10       &n bsp;0.24±0.03        0.63± 0.29        1.56± 0.41        2.79± 0.71        3.84±0.66

3.        10       &n bsp;0.26±0.04        0.84± 0.27        1.89± 0.26        3.57± 0.64        5.21±0.78

4.        10       &n bsp;0.14±0.02        0.26± 0.04        0.64± 0.10        0.96± 0.18        1.12±0.23

1  .W-VV＋Hepa-CEA-  2.  CEA-rV＋Hepa-CEA-   3.  W-VV＋Hepa-CEA＋  4.  CEA-rV＋Hepa-CEA＋

   2.4 CEA-rV的临床应用研究结果 见表3

						CEA（ng/ul）	AFP（ng/ul）
编号	性别	年龄	诊?? 断	治疗前	后	治疗前	后
1	男	45	直肠癌术后复发	200	20
2	男	66	结肠癌术后复发	103	20
3	男	32	直肠癌化疗后	231	失访
4	男	48	肺腺癌ⅢA	570	145
5	男	46	肺鳞癌ⅢB	105	103
6	男	50	肝癌术后复发			45000	660

   结果表明CEA-rV对CEA阳性的结直肠癌患者的三例病人中,有效率为100%。对CEA异常的二例肺癌，一例有效（ 肺腺癌）有效(50%)。1例肝癌AFP极度升高者，本不是CEA-rV明显的适应症，但患者积极要求使用。其症状及AFP明显好转，是否 CEA-rV的作用，有待进一步研究。

   不良反应，整个CEA-rV的治疗过程中未见任何严重不良反应。例4在CEA-rV的 第一次注射的当天晚上一度发热37.80C。未经处理,3h后自行消退，例1在第一次注射后有嗜睡现象，从上午10点睡到下午4点, 余无不适。结果表明，CEA-rV临床应用安全，无严重不良反应。典型病例如: ①

   胡XX,男45岁,IT工程师,直肠癌根治术后一年复发,伴骨转移,剧烈疼痛:血清CEA成倍上升,高达 200ng/ml.当地放疗、化疗治疗效果不佳。用生物治疗和CEA-rV后，疼痛明显减轻，止痛药美施康定由原来每天3-4粒减到每天一 粒或停用，血清CEA降到20ng/ml。 ②

   郭XX，男，66岁，退休干部。两年前行结肠癌根治术，一年前复发转移，当地检查结果：血清 CEA103ng/ml。CT和B超提示肝内两个大小2cm的转移灶。用生物治疗和CEA-rV接种后，血清CEA降到20ng/ml。B超提示肝内转移灶 消失。 ③

   郭XX，女，48岁，印尼华侨。左上肺腺癌（8cm×7cm）伴胸水及左锁骨上淋巴结转移（3.5cm×4cm ）.血清CEA高达353 ng/ml。生物治疗和CEA-rV一疗程后,肺腺癌缩小45%(由8cm×7cm缩小至6cm×6cm),锁骨上淋巴结缩小40%(由 3cm×4cm缩小至2.5cm×3cm).血清CEA降到145.7 ng/ml。 ④

   朱XX,男,50岁,公司经理,4个月前行肝细胞癌切除术,一个月前发现肿瘤复发转移:肝内有二个2.1cm ×2.4cm的复发灶,双肺有8个转移灶,最大的约1.1cm×1.2cm.血清AFP达4.5万ng/ml以上(正常20以下).生物治疗和CEA-rV治疗后 复查:肝内复发灶消失,双肺转移灶由8个减少到4个,最大的缩小50%(由1.1cm×1.2cm缩小到0.8cm×0.8cm),血清AFP由4.5万ng/ml 降至1.2万ng/ml.治疗半个月后,血清AFP降至660ng/ml.

   3.讨论

   恶性肿瘤的手术治疗,虽能有效地去除肉眼可见的肿瘤，但对术后的复发和转移尚无能为力。放疗和化疗除 具有严重的毒副作用外，由于许多肿瘤细胞对其不敏感，其疗效亦不理想。肿瘤的免疫生物治疗是肿瘤防治的新模式，主要是通 过一定的技术方法增强肿瘤抗原的免疫性，诱导机体产生抗肿瘤特异性的杀伤细胞和体液免疫反应，杀伤肿瘤细胞(6),CEA是一 种重要的肿瘤相关抗原，90%的胃肠道肿瘤，70%的非小细胞肺癌及50%的乳腺癌都有CEA的表达，人们谓之CEA阳性肿瘤（2）.由 于CEA的抗原性弱，难以激刺机体的特异性免疫系统，而使肿瘤细胞逃避杀伤.为了提高机体的特异杀伤能力，利用CEA基因重组 的痘苗病毒（CEA-rV），通过其诱导机体免疫系统产生CEA特异性的杀伤细胞和体液免疫应答反应（7），来达到防治CEA阳性肿 瘤的目的。

   国内外的最近研究(8-9)也证明了CEA基因痘苗对CEA阳性肿瘤的疗效,并提示疗效的机理是激活了机体的特异性 细胞免疫反应.JohnLM等(10)的Ⅰ期临床研究表明:用牛痘病毒重组痘苗rV-CEA(6D)-Tricom治疗58例进展性CEA阳性肿瘤患者,有 23例(40%)4个月内病情稳定,其中14例病情稳定大于6个月,11例血清CEA水平降低或稳定,并且无明显毒副作用.

   本研究结果表明：（1）通过先接种CEA-rV使机体产生对 CEA阳性肿瘤的特异性免疫能力，再接种CEA阳 性肿瘤细胞的动物,CEA-rV预防组无肿瘤发生.说明CEA-rV对实验性CEA-rV阳性肿瘤有彻底的预防作用。(2)通过先接种CEA阳性的 肿瘤细胞,让实验动物产生肿瘤后,再接种CEA-rV进行特异性免疫治疗的实验结果, CEA-rV治疗组肿瘤体积平均1cm3,而其余3组肿 瘤体积平均5 cm3。说明CEA-rV对CEA阳性肿瘤的生长有强烈的抑制作用，抑制率达80%。（3）初步临床应用结果表明，CEA-rV对 CEA阳性的结直肠癌患者和肺腺癌患者有一定的治疗作用。而且没有严重的毒副作用。

   结论和展望:CEA-rV实验性CEA阳性的肿瘤具有良好的预防和治疗作用，而且预防作用更佳，可达100%的预防 效果。应用研究表明:CEA-rV对CEA阳性的直结肠癌和肺腺癌患者有明显的治疗作用和可靠的安全性。故有人(7)设想CEA-rV术后 及时用于CEA阳性肿瘤患者，对防止复发和转移可望有更好的效果，若能把CEA-rV转染树突状细胞诱导对CEA阳性肿瘤的特异性T 细胞用于临床，则前景更加可观(11、12)。

   参考文献

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   12.吴军,杨太成,赖晃文等.癌胚抗原重组痘苗病毒转染树突状细胞诱导CEA特异性T细胞 免疫 (J).肿瘤防治研究,2002,29(5):353-355